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(AD1003)Ad-dn-AKT

产品编号: AD1003

产品规格: 200ul,2x10^9 PFU/ml


  

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  • (AD1003)Ad-dn-AKT 说明书

    产品简介

    重组腺病毒表达带有HA标签的钝化Akt (Recombinant adenovinscs expressinghemagglutinin (HA)-agged dominant-negative (dn)Akt, Ad-dn-Akt)。

    Akt是一种丝/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, Akt) 也被称为蛋白激酶B(protcin kinase B, PKB),分子量约为57kD,是PI3K-Akt信号通路的重要组分部分: PI3K将活化产生的3.4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)与Akt中的PH结构域结合后相互作用,使得Akt的构象变化,导致Akt的两个重要磷酸化位点暴露(Thr308位f激酶活性区,Ser473位于羧基末端的调节区).Thr308磷酸化对于Akt的活化是必需的,但同时位于羧基端Ser473残基磷酸化对于Akt的完全活化也是必需的。活化后的Akt发生转位,进入细胞质和细胞核,而这些区域则含有Akt的作用底物,如Bad、Caspase9、NF-xB、 Forkhcad、 mTOR、Par-4、p21等,从而介导细胞生长,经多种途径促进细胞存活。Akt是重要的抗细胞凋亡调节因子。Akt处于多条信号通路的重要交叉点,通过影响下游多种因子的活化状态,发挥着抑制调亡、促进增殖的关键作用。

    腺病毒感染细胞后为瞬时表达,通常不会与基因组DNA重组,不能用于筛选稳定细胞株。本产品感染体内外细胞后,有效表达时间通常不少于7天,不同细胞和组织的有效表达时间有所不同。感染10-14天后蛋白的表达很可能会大大减弱。

    使用说明

    1. 感染条件的确定:

    不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的,如果是初次使用腺病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。

    a. 细胞培养(以6孔板Hela细胞为例,其它培养板或培养皿参考6孔板进行操作):感染前一天在6孔板中以5×10^5/孔接种Hela细胞,每孔加入2ml完全培养液(具体的接种数量由细胞大小和细胞生长速度而定),使第二天病毒感染时细胞密度达到约70%左右。

    b. 按照MOI 分别为2、5、10、20、40,计算所需病毒量,计算方法请参考附录。

    c. 冰上解冻病毒,混匀后备用。

    d. 从细胞培养箱中取出6孔板,在显微镜下确定每孔的细胞均生长良好.分别加入特定MOI值的病毒液,同时设置未加入病毒的细胞孔作为对照组。对于培养液体积比较小的多孔板,例如96孔板和48孔板,也可以先把病毒用培养液稀释至所需的MOI值后再加入。

    e. 感染后约12h,除去含有病毒的培养液,每孔加入2ml新鲜的完全培养液,继续培养24h后,收集细胞做western,或提取mRNA做qPCR。以不显著影响细胞生长、并由较强蛋白表达的MOI值为最佳条件。

    2. 感染细胞

    根据步骤1. 获得的最佳MOI进行感染实验。

  • 组分和说明
    本产品的滴度≥2×10^9 pfu/ml。如果按照20 MOI感染6孔板的细胞,每孔50万细胞计算,200ul

    本产品共可以感染40个孔;如果按照20 MOI感染24孔板的细胞,每孔10万细胞计算,200ul

    本产品共可以感染200个孔。如果MOI值提高,则相应可以感染的孔数会减少;如果MOI值降低,则相应可以感染的孔数会增加。

     

    保存条件
    -80℃保存,一年有效。-20℃保存,1-2个月内有效。4℃保存,一周内有效。

  • 注意事项
    1、反复冻融会降低病毒滴度,如有必要请在收到本产品后分装保存。病毒融解后,如果在一周内使用,可以放置于4℃。如果-80℃保存时间超过一年,可能会导致滴度下降,此时建议重新测定病毒滴度。
    2、腺病毒感染需要细胞表面的CAR受体,请确认拟使用的细胞或组织可以被腺病毒感染。
    3、本产品使用前请仔细阅读《腺病毒使用安全规范》。本产品生物安全等级为Biosafety Level 1 (BSL-1),没有确凿证据显示会导致健康成人产生疾病(Not known to consistently cause diseases in healthy adults),可以按照常规的微生物实验操作要求进行操作(Standard microbiological practices)。
    4、本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
    5、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

     

    附录

    病毒MOI的计算
    MOI (Multiplicity of Infection)定义:病毒感染细胞时,病毒数量与细胞数量的比值。
    Pfu (Plaque forming units)定义:具有生物活性的病毒颗粒数量。
    可以根据如下公式计算所需pfu:
    所需pfu=细胞数量×MOI
    例如,需要向1×10^5细胞中加入20 MOI的病毒,即所需pfu=(1×10 ^5cells)×(20 MOI)=2×10 ^6pfu。若病毒母液滴度为1×10^9pfu/ml,则细胞培养液中应加入(2×10^6pfu)/(1×10p^9fu/ml)=0.002ml病毒母液,即2μl病毒母液。

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