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(W001A)ScibenECL Super超敏化学发光试剂盒

产品编号: W001A

产品规格: 200ml 100ml 50ml 25ml


  

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  • ScibenECL Super超敏增强型化学发光试剂盒说明书

    200ml(100mlA液/100mlB液)、100ml(50mlA液/50mlB液)、50ml(25mlA液/25mlB液)、25ml(12.5mlA液/12.5mlB液)

    产品描述

    善本生物ScibenECL超敏增强型化学发光试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶(HRP)的抗体及其关联的抗原。其原理是,蛋白质或核酸在电泳后转移到PVDF或NC印迹膜上,以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白,或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。经洗膜后,用本产品A液和B液等体积混合成工作液在室温侵透膜孵育3-5分钟即可,接着将印迹膜放入两张透明塑料薄膜之间固定于X光片曝光暗盒内,在暗室环境中将X光胶片压在膜上曝光数秒到数小时,显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰呈现在X光胶片上,可用扫描仪扫描。也可不进行X光胶片曝光直接对印迹膜进行荧光CCD扫描。

    本产品采用独特的增强发光底物系统,引入新型稳定发光成分,发光值增高数十到千倍以上,发光延续时间长,衰退缓慢;具有曝光背景低,稳定性以及灵敏度高的特性和优势。

     

    储存方法

    4 ℃密封避光保存1年以上。短期可放置室温。

  • 使用方法

    1、执行常规SDS-PAGE、转膜和Western Blot步骤。注意用HRP标记lgG或用一抗-链亲和素-生物素-HRP夹法。

    操作概述

    注:优化抗原和抗体的浓度。必须使用建议的抗体稀释度,以保证阳性结果。

    1)将一抗浓度稀释到0.1~1 mg/ml(以1 mg/ml储存液稀释1:1000~1:10000倍);

    2)将二抗浓度稀释到20~100 ng/ml(以1 mg/ml储存液稀释1:10000~1:50000倍);

    3)将A液和B液两种组份按1:1比例混合,制备发光工作液;

    (注:暴露于日光或任何其他强光可能损害工作液,为获得最佳结果,将此工作液保存在琥珀色瓶中,并避免长期暴露于任何强光。短时间暴露于实验室常规照明不会损害该工作液)

    4)将印迹膜在ECL底物工作液中孵育3~5分钟;

    5)吸出多余试剂。用清洁的塑料膜盖住该印迹膜;

    6)使印迹膜在X光胶片上曝光。

    2、Western Blot最后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液:分别取等体积的溶液A和B,放入干净容器中混合。建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。

    3、用镊子取出膜,搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液(0.01~0.1 ml发光工作液/cm2膜)中,与发光工作液充分接触。室温孵育3分钟,准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度,有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应,使用过少的发光工作液不利反应进行,也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。

    4、用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

    5、打开X光胶片暗盒,在暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将Western blot膜贴在保鲜膜上,将保鲜膜折起来完全包裹Western Blot膜,去除气泡和皱褶,可剪去边缘部多余保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖Western Blot膜的保鲜膜固定在暗盒内,蛋白带面向上。

    6、暗房内压X光胶片,分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。

  • 注意事项

    1、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2、步骤1~5可在日光灯下操作。

    3、曝光时间过长或蛋白过量,均会加深背景并使条带强弱变化失去线性关系;曝光不足则条带模糊。

    4、发光工作液室温下5小时有很好的稳定性。发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见,低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光。因此,弱带可曝光1~10小时。如果曝光后条带不佳,可用洗膜缓冲液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL发光和曝光。

    5、由于发光液灵敏度高,抗体浓度过高将造成高背景或没有条带,导致失败,所以要适度优化抗体浓度。

    6、某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光,建议将膜放在两张透明塑料薄膜之间曝光更好。

    7、注意不要将多张膜放在同一个洗膜盒内洗膜,相互吸附或摩擦可能引起较深背景。

    8、固定好膜在曝光暗盒内的位置不滑动,以便能通过使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签精确确定胶片上条带的位置和大小。

    9、叠氮钠(NaN3)能抑制HRP活性,回收第二抗体应避免使用NaN3,如必需使用勿超过0.01%。

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